藥物安全與國(guó)計(jì)民生息息相關(guān),世界各國(guó)都越來(lái)越重視藥物質(zhì)量安全。2010年國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)發(fā)布了Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則,ICH*Q3D準(zhǔn)則規(guī)定了24種有毒元素每天攝入的限制量,并要求對(duì)這些元素進(jìn)行高靈敏度、高精度測(cè)量。美國(guó)、歐盟也進(jìn)一步限制了藥品中的元素雜質(zhì)水平,藥品中元素雜質(zhì)的控制越來(lái)越受到關(guān)注。
各種化學(xué)和儀器分析方法在解決藥品研發(fā)和質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用。目前常用于藥品質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的分析技術(shù)主要包括:化學(xué)法、色譜法、光譜法、電化學(xué)法、電泳法、流動(dòng)注射和順序注射分析以及聯(lián)用技術(shù)等。X射線熒光光譜分析法(X-rayFluorescenceSpectrometry,XRF)是元素成份分析中最為有效的方法之一,此方法測(cè)試元素范圍廣,可測(cè)定原子序數(shù)5B-92U(Be)的所有元素,并可多元素同時(shí)測(cè)定,是一種快速且精密度高的分析方法,廣泛應(yīng)用于冶煉、地礦、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥、考古、工業(yè)制造和司法鑒定等眾多領(lǐng)域。x射線熒光光譜具有快速、無(wú)損、前處理簡(jiǎn)單、分析精度高、分析范圍廣、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。在藥品檢測(cè)方面,XRFS多用于藥品的元素成分分析以及鑒定評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制。
一、X射線熒光光譜法(XRFS)在藥物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的現(xiàn)狀
《美國(guó)藥典》〔USP〕41版通則〈735〉、《歐洲藥典》〔EP〕9.0版通則〈2.2.37〉和《英國(guó)藥典》〔BP〕2019版〈附錄ⅡK〉均收載了XRF技術(shù)。USP介紹了XRF的定義、儀器原理、儀器性能、測(cè)定方法、確認(rèn)和驗(yàn)證等內(nèi)容。EP介紹了XRF的定義、原理、測(cè)定方法、校正方法及計(jì)算公式。BP介紹了XRF的原理、儀器、基體效應(yīng)和干擾、樣品制備、測(cè)定方法、儀器性能控制和驗(yàn)證要求。BP還指出XRF作為質(zhì)量控制或過程控制方法,廣泛用于篩選原料藥和制劑中的元素雜質(zhì)。由于XRF的非破壞性,適用于過程分析技術(shù)(PAT),如分析原料藥中殘留的痕量催化劑。
2020年版中國(guó)藥典(四部)新增通用技術(shù)名單包含〈0461X射線熒光光譜法〉,P57。
(2020年版中國(guó)藥典(四部)〈0461X射線熒光光譜法〉)
標(biāo)志著我國(guó)藥物雜質(zhì)元素分析上邁出了重要一步,有效補(bǔ)充了現(xiàn)有分析手段,特別是在快速篩選和質(zhì)量控制上。
二、X射線熒光光譜儀(XRF)的原理、分類和特點(diǎn)
X射線熒光光譜(XRF)法是利用初級(jí)X射線光子激發(fā)待測(cè)物質(zhì)中的原子內(nèi)層電子,使之產(chǎn)生特征X射線熒光(次級(jí)X射線),通過精確測(cè)量熒光的能量或波長(zhǎng),根據(jù)波長(zhǎng)與元素序數(shù)間的關(guān)系以及熒光強(qiáng)度與含量的正比關(guān)系,對(duì)被測(cè)樣品中的元素進(jìn)行定性、定量分析的方法。
XRF具有分析速度快、分析元素范圍廣、前處理簡(jiǎn)單、污染小、成本低以及無(wú)損等優(yōu)點(diǎn),可用于各類樣品中主、次、痕量多元素同時(shí)測(cè)定。根據(jù)分光方式及光路的不,XRF可分為波長(zhǎng)色散型WDXRF、能量色散型EDXRF、全反射型(TXRF)等。WDXRF分辨率高、檢出限低,體積大,需要較強(qiáng)的光源和專用的晶體光學(xué)元件,價(jià)格高。EDXRF不使用分光晶體,光路相對(duì)簡(jiǎn)單,光源功率也相對(duì)較小,價(jià)格低。自20世紀(jì)60年代早期開始逐漸商品化,隨著硬件和軟件的不斷發(fā)展,逐漸成本元素成份分析的主要手段之一。目前同時(shí)配備XRF、ICP、ICP-MS是國(guó)內(nèi)外分析實(shí)驗(yàn)室的趨勢(shì),利用XRF分析含量較高的元素,用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS分析低濃度的元素。
(波長(zhǎng)色散X射線熒光光譜儀(WDXRF)原理)
三、XRF在藥物元素分析中的應(yīng)用
1、在藥物研發(fā)中的應(yīng)用
制藥企業(yè)通常將新藥研究重點(diǎn)聚焦于未滿足的醫(yī)療需求上,新藥的研發(fā)速度往往由患者驅(qū)動(dòng)。因此藥物研發(fā)過程中快速做出決策,可更快地提高患者的治愈率,元素雜質(zhì)分析是提高研發(fā)效率的一個(gè)重要步驟。金屬催化劑通常用于原料藥的合成中,研發(fā)者需要監(jiān)測(cè)各種原料和合成工藝中金屬催化劑的殘留情況,從而實(shí)施有效的控制策略。通常使用靈敏度高、精密度高和選擇性好的電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-OES或ICP-MS)對(duì)藥物中的元素雜質(zhì)進(jìn)行分析。然而在藥物研發(fā)期間許多樣品不需要這些昂貴、費(fèi)時(shí)、靈敏度高的技術(shù)。研發(fā)者通常需要快速確定元素含量,以提高優(yōu)化合成工藝的效率。XRF可更快速、更便捷地測(cè)定原料、中間體和研發(fā)樣品中的元素雜質(zhì)含量,同時(shí)保證必要的準(zhǔn)確度。XRF可替代傳統(tǒng)的ICP-OES測(cè)定金屬雜質(zhì)含量,快速確定金屬催化劑去除工藝的有效性,可為原子光譜和工藝化學(xué)部門節(jié)省近兩個(gè)月的全職人力工時(shí),同時(shí)節(jié)省溶劑、氬氣和耗材等使用費(fèi)用。
2、在原料藥元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用
作為提高藥物安全性和有效性的一部分,制藥企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)原料藥(API)的雜質(zhì)控制十分重視。元素雜質(zhì)可以從各種來(lái)源(如原料、試劑、溶劑、催化劑、反應(yīng)容器、管道和其他用于合成藥物的設(shè)備)引入原料藥中。由于某些元素具有潛在的毒性,美國(guó)FDA指南指出,在制藥生產(chǎn)中控制殘留元素含量至關(guān)重要。MarguE等利用WDXRF測(cè)定原料藥中的金屬雜質(zhì)鐵、鋅、鉻、鎳方法的檢出限和定量限滿足歐洲藥品評(píng)價(jià)局(EMA)和ICHQ2(R1)的要求,適用于原料藥目標(biāo)無(wú)機(jī)雜質(zhì)的定性和定量檢測(cè)。與藥典的重金屬目視比色檢測(cè)方法不同,該技術(shù)可以輕松實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,是快速常規(guī)分析的理想工具。催化在醫(yī)藥化學(xué)工業(yè)中具有重要的作用,它可以減少碳-碳和碳雜原子鍵形成過程中的活化能,從而提高結(jié)構(gòu)改造的效率,降低總成本和時(shí)間。鈀通常被認(rèn)為是原料藥形成碳-碳和碳雜原子鍵應(yīng)用最廣泛的金屬,在醫(yī)藥工業(yè)中廣泛用于催化反應(yīng),但必須將其除去后方可成為藥用原料。MarguE等通過X射線熒光光譜儀建立了一種簡(jiǎn)單、快速、可靠的分析方法,可測(cè)定三唑類抗真菌原料藥中催化劑靶的殘留量。
EDXRF類型中的TXRF比傳統(tǒng)EDXRF的背景信號(hào)更低且檢測(cè)限低3個(gè)數(shù)量級(jí),還具有動(dòng)態(tài)范圍寬(至少4個(gè)數(shù)量級(jí))、所需樣品量小(ug)、定量簡(jiǎn)單、基體效應(yīng)可忽略等優(yōu)點(diǎn),可通過內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)對(duì)原子序數(shù)在14~92內(nèi)的多元素快速定量測(cè)定,是一種快速的元素篩選分析技術(shù)。WagnerM等利用TXRF研究了不同來(lái)源的胰島素、普魯卡因和色氨酸樣品中的微量元素的含量比例,得到了元素指紋圖譜相關(guān)信息,能夠區(qū)分不同生產(chǎn)純化工藝的不同批次的樣品。LsztityA等利用TXRF篩查發(fā)現(xiàn),左旋多巴中金屬含量低于5ug/g,亞葉酸鈣中鐵、鋅、鍶的含量分別為為44、10、6ug/g,馬來(lái)酸依那普利中鐵的含量為17ug/g,AntoszFJ等利用TXRF對(duì)原料藥樣品中的鈀和銅進(jìn)行了定量分析,測(cè)定結(jié)果在檢出限、定量限、準(zhǔn)確度和精密度方面與ICP-MS相當(dāng)。
3、在藥用輔料元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用
2015版《中國(guó)藥典》采用原子吸收光譜法(AAS)測(cè)定明膠空心膠囊中的有毒重金屬鉻的殘留,該法需要復(fù)雜的前處理過程,時(shí)間消耗較長(zhǎng)。李俊卿、尹利輝等建立了EDXRF快速檢測(cè)明膠空心膠囊中鉻的含量。方法的檢測(cè)限為10mg/Kg,與AAS測(cè)試結(jié)果比較,Cr含量大于10mg/Kg的陽(yáng)性樣品的檢測(cè)率為100%。該方法可以無(wú)損傷直接測(cè)試樣品,一次同時(shí)分析多種元素,分析時(shí)間,4分鐘即可篩查出一個(gè)樣品,大大提高了分析效率。
4、在制劑元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用
對(duì)患者而言,藥物制劑的安全性和有效性更為重要。因此袁重點(diǎn)研究XRF在制劑元素雜質(zhì)分析中的應(yīng)用比工藝研發(fā)時(shí)分析個(gè)別原料藥的元素雜質(zhì)殘留量更有意義。GoncalvesLML利用WDXRF對(duì)兩種原研藥和仿制藥中的金屬元素雜質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示W(wǎng)DXRF在一定范圍內(nèi)具有可接受的線性、精密度和準(zhǔn)確度,適用于藥物制劑中銅、鋅、鐵、鉻雜質(zhì)的測(cè)定,是藥典中重金屬目視比色檢測(cè)法、AAS、ICP的良好替代方法。
由于制樣簡(jiǎn)單、設(shè)備和分析成本較低,以及可對(duì)大量樣品進(jìn)行快速篩查,XRF已被美國(guó)FDA用于各種監(jiān)管用途。
四、2020《中國(guó)藥典》〔四部〕〈0461X射線熒光光譜儀〉通用技術(shù)要求
X射線熒光光譜法(XRF)是一種基于測(cè)量由初級(jí)X射線激發(fā)的原子內(nèi)層電子產(chǎn)生特征次級(jí)x射線的分析方法。XRF可用于液體、粉末及固體材料的定性、定量分析。XRF儀可分為波長(zhǎng)色散型(WDXRF)和能量色散型(EDXRF)。
當(dāng)X射線照射到供試品時(shí),供試品中的各元素被激發(fā)而輻射出各自的熒光x射線。通過準(zhǔn)直器經(jīng)分光晶體分光,按照布拉格定律產(chǎn)生衍射,使不同波長(zhǎng)的熒光x射線按照波長(zhǎng)順序排列成光譜,不同波長(zhǎng)的譜線由探測(cè)器在不同的衍射角上接收。根據(jù)測(cè)得譜線的波長(zhǎng)識(shí)別元素種類;根據(jù)元素特征譜線的強(qiáng)度與元素含量間的關(guān)系,計(jì)算獲得供試品中每種元素含量百分?jǐn)?shù),即為X射線熒光光譜分析法。
供試品的制備 液體供試品可以直接進(jìn)樣分析,固體供試品可以直接壓片或與適當(dāng)?shù)妮o劑混合處理后壓片進(jìn)樣分析。
儀器的校正和檢定 儀器使用前應(yīng)使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或其他可溯源的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正。
測(cè)定法 X射線熒光光譜法中一般應(yīng)選擇強(qiáng)度大、干擾少、背景低的特征譜線作為分析線。
定性分析 根據(jù)每種元素特征x射線熒光譜線可對(duì)供試品中所含元素種類進(jìn)行定性分析。
定量測(cè)定法 (1)
標(biāo)準(zhǔn)曲線法
液體樣品采用元素不同濃度的對(duì)照品或者采用元素分級(jí)稀釋法制備不同濃度的對(duì)照品供檢測(cè)分析用,固體樣品采用不同含量的對(duì)照品或者采用標(biāo)準(zhǔn)加人法制備不同含量的對(duì)照品供檢測(cè)分析用。對(duì)照品應(yīng)與供試品的化學(xué)組成和物理性質(zhì)等方面一致。分別測(cè)定系列對(duì)照品的X射線強(qiáng)度,以待測(cè)元素的濃度(含量)為橫坐標(biāo),以X射線強(qiáng)度為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)在測(cè)定前或定期進(jìn)行校準(zhǔn)。
(2)
內(nèi)標(biāo)法
將相同量的內(nèi)標(biāo)元素分別加人到待測(cè)元素已知并且元素濃度(含量)呈梯度的一-組樣品中制成系列對(duì)照樣品。在選定的分析條件下分別測(cè)量對(duì)照品中待測(cè)元素與內(nèi)標(biāo)元素的X射線強(qiáng)度,計(jì)算待測(cè)元素與內(nèi)標(biāo)元素的X射線強(qiáng)度比,以該強(qiáng)度比為縱坐標(biāo),待測(cè)元素濃度(含量)為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在待測(cè)樣品中也加入相同量的同一種內(nèi)標(biāo)元素,制成供試品,同法測(cè)量并求得X射線強(qiáng)度比,由標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)元素的濃度(含量)。
(3)
標(biāo)準(zhǔn)加入法
取相同量供試品(或相同體積供試品溶液)6份,除第一份外,在其他幾份中,分別精密加入不同量的待測(cè)元素對(duì)照品(或?qū)φ掌啡芤?,制成系列待測(cè)樣品;在選定的分析條件下分別測(cè)定,以待測(cè)元素X射線強(qiáng)度為縱坐標(biāo),待測(cè)元素加入量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將標(biāo)準(zhǔn)曲線延長(zhǎng)交于橫坐標(biāo),由交點(diǎn)與原點(diǎn)的距離求算供試品中待測(cè)元素的濃度(含量)。此法要求待測(cè)元素的濃度(含量)與X射線強(qiáng)度呈線性關(guān)系。
(4)
數(shù)學(xué)校正法
數(shù)學(xué)校正法中的經(jīng)驗(yàn)系數(shù)法、經(jīng)驗(yàn)系數(shù)與基本參數(shù)聯(lián)用法等,用于各種不同分析對(duì)象時(shí),可有效地計(jì)算和校正由于基體的吸收和增強(qiáng)效應(yīng)對(duì)分析結(jié)果的影響,對(duì)于譜線干擾和計(jì)數(shù)死時(shí)間,也可以得到有效的校正。
理學(xué)X射線熒光光譜儀助力藥物中金屬元素成份分析
WDXRF/TXRF
五、小結(jié)
XRF法具有快速、準(zhǔn)確、非破壞性等優(yōu)點(diǎn),分析元素覆蓋面廣(包括鈹~鈾),分析濃度范圍寬(0.0001%~100%),分析樣品可以是固體或液體。而隨著科技的不斷發(fā)展多種分析方法和技術(shù)的聯(lián)用將是未來(lái)的發(fā)展方向,XRF法的應(yīng)用范圍也將不斷擴(kuò)大。
可作為AAS、ICP-AES和ICP-MS等元素分析技術(shù)的有效補(bǔ)充,可定量、定性分析原藥、輔料、制劑、包材中的殘留元素。
目前USP、EP、BP、《中國(guó)藥典》均已收載XRF作為法定的一般檢測(cè)方法,有利于規(guī)范和指導(dǎo)XRF在藥品質(zhì)量控制中的應(yīng)用,藥品中元素雜質(zhì)的檢測(cè)又增加一種有效的質(zhì)量控制方法。
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